用分子生物学的手段怎样鉴定细菌的种属
一、用分子生物学的手段怎样鉴定细菌的种属
细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA。rRNA基因由保守区和可变区组成。
1、16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
2、5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究。
3、23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高。
因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
【操作步骤】
（一）细菌基因组DNA提取
1. 挑单菌落接种到10 mL LB培养基中37℃振荡过夜培养。
2. 取2 mL培养液到2 mLEppendorf管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。
3. 加140 μLTE打散细菌，再加入60 μL 10 mg/ml的溶菌酶。37℃放置10分钟。
4. 加入400 μL Digestion Buffer，混匀。再加入3 μL Protein K，混匀，55℃温育5分钟。
5. 加入260 μL乙醇，混匀，全部转入UNIQ-10柱中。10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。
6. 加入500 μL 70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。
7. 重复第六步。
8. 再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5 mL的离心管。
9. 加入50 μL预热(60℃)的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。12000 rpm离心2分钟，流下的液体即为基因组DNA。
10. 电泳。取3 μL溶液电泳检测质量。
（二）PCR扩增
1. 根据已发表的16S rDNA序列设计保守的扩增引物。
16S (F) 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
16S (R) 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
2. PCR扩增体系：
在0.2 mL Eppendorf管中加入1μL DNA，再加入以下反应混合液：
16S (F) 1μL (10μM)
16S (R) 1μL (10μM)
10×PCR Buffer 5 μL
dNTP 4 μL
Taq酶 0.5 μL
加ddH2O使反应体系调至50 μL，简单离心混匀。
3. PCR反应
将Eppendorf管放入PCR仪，盖好盖子，调好扩增条件。扩增条件为：
94℃ 3 min
94℃ 30 sec
50℃ 45 sec 35 cycles
72℃ 100 sec
72℃ 7 min
4. PCR产物的电泳检测
拿出Eppendorf管，从中取出5 μL反应产物，加入1μL上样缓冲液，混匀。点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶中。电泳1 hr。在紫外灯下检测扩增结果。
（三）扩增片段的回收
根据上步实验结果，如果扩增产物为唯一条带，可直接回收产物。否则从琼脂糖凝胶中切割核酸条带，并回收目的片段。
1）称量一2 mL.的Eppendorf管质量，记录。
2）在紫外灯下切割含目的条带的凝胶，放入2 mL的Eppendorf管内，称量。计算凝胶质量。
3）每100 mg凝胶加入100 μL Binding Buffer，混匀。60℃温育至凝胶融化
4）全部转入UNIQ-10柱中。10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。
5）加入500 μL Binding Buffer，10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。
6）加入70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。
7）再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5ml的离心管。
8）加入30 μL预热的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。12000 rpm离心2分钟，流下的液体即为回收的DNA片段。
（四）DNA片段测序
将回收的片段送至生物公司测序，测序引物为16S PCR引物。
根据测序结果，到NCBI上进行比对，确定该未知菌的种属。
二、要区分球形细菌与酵母菌区分依据是
酵母菌是真菌 真核生物 具有核膜包被的细胞核 细菌是原核生物
三、酵母菌和细菌在外观形态上有何区别
在四大类微生物的菌落中，细菌和酵母菌的形态较接近，放线菌和霉菌形态较相似。 ... 它们之间的区别如下： 细菌：由于细胞小，故形成的菌落也较小，较薄、较透明且有“细腻”感。 ... 此外，有些细菌具有特殊的细胞结构，因此，在菌落形态上也有所反映，如无鞭毛 ... 气生菌丝向空间生长，菌丝之间无毛细管水，因此菌落外观呈干燥、不透明的丝 ...希望您满意我的回答.
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